Последовательность следующего поколения и диагностика заболеваний

4 августа 2021 г  Next-Generation Sequencing and the Diagnosis of Disease 0 идеи из промышленностиДжон РоссенПрофессор медицинской микробиологииУниверситет Гронингена

В этом интервью News-Medical рассказывает профессору Джону Россену из Университета Гронингена о его исследованиях по секвенированию ДНК и микробиологии и о том, как его работа получает пользу от Tecan.

Не могли бы вы начать с краткого обзора ваших знаний и истории секвенирования ДНК?

Я назначен профессором в Университете Гронингена и Университете Юты, Медицинский факультет. В настоящее время я также работаю в IDbyDNA, организации, которая разрабатывает и продает программное обеспечение для анализа метагеномических данных.

Секвенирование по существу началось после того, как ДНК была обнаружена. Первый бактериальный геном был секвенирован в 1995 году, и с тех пор эта область развивалась очень быстро, и было открыто и разработано много новых технологий. В настоящее время мы можем упорядочить десятки бактерий параллельно, чтобы генерировать последовательности цельного генома.

Возможности секвенирования в клинической микробиологии действительно начались с секвенирования всего генома. Секвенирование всего генома использует бактериальную культуру, из которой мы можем извлечь ДНК, создать библиотеки ДНК, начать секвенирование, ввести патогены и интерпретировать результаты.

Каковы некоторые из преимуществ и приложений секвенирования следующего поколения, в частности?

Например, секвенирование следующего поколения (NGS) может использоваться для выявления вспышек. В одном тематическом исследовании в 2014 году в больнице наблюдалось увеличение энтерококка, устойчивого к ванкомицину, в нескольких различных отделениях. Мы секвенировали все изоляты, полученные от пациентов, и увидели, что данные были сгруппированы.

Если бы мы использовали обычный многолокальный набор текста последовательности (MLST) только с семью аллелями, у нас была бы менее дискриминационная сила, и все эти результаты были бы в одном кластере.

Тем не менее, мы использовали основной геном MLST, чтобы исследовать гораздо больше аллелей, увеличивая дискриминационную силу и видя различные кластеры. По сути, это то, что может предоставить NGS, и это только один пример того, как это было выгодно в клинической микробиологии.

NGS также предлагает ряд других потенциальных приложений, например, рабочий процесс секвенирования на основе ампликона.

При работе с образцом пациента, можно включить положительный и отрицательный контроль, аналогично процессу при использовании ПЦР в реальном времени. Также можно увеличить выборку пациента с помощью внутреннего контроля, а затем извлечь РНК и ДНК для выполнения ПЦР. Это извлекается непосредственно из клинического материала, это означает, что культура не вовлечена.

Методы NGS могут использоваться для усиления определенных целей, например, генов 16S или AMR. После усиления мы можем начать секвенирование ампликонов, обнаруживать выбранные патогены и интерпретировать результаты для создания лабораторного отчета.

Ранний пример подхода секвенирования следующего поколения на основе ампликона был фактически разработан компанией BioInnovation Solutions, ранее Pathogenica.

Компания разработала группу, в которой присутствовало несколько внутрибольничных инфекционных бактерий, а также несколько генов AMR. В технологии использовалось 298 зондов, поэтому она равнялась 144 ПЦР.

Мы смогли получить результаты за 24-36 часов, используя эту систему, опубликовав ряд наших результатов. К сожалению, эта компания больше не существует, и, несмотря на то, что методология была очень многообещающей, она не была принята в этой области в то время.

Как эта работа связана с разработкой и применением метагеномики в клинической микробиологии?

Основываясь на наших результатах, мы смогли использовать клиническую метагеномику дробовика для внедрения NGS в лабораторию клинической микробиологии не только с точки зрения типирования бактерий, но и для приложений, связанных с реальной диагностикой.

Метагеномика не зависит от культуры и беспристрастна, что является ключевым преимуществом по сравнению с традиционным секвенированием всего генома.

Мы можем использовать метагеномику для обнаружения бактерий и микробов. Мы можем использовать его для изучения реакции хозяина, создания прототипов и эпи-печати. Мы также можем использовать его для идентификации патогенов, что исторически было проблемой при использовании бактериального секвенирования всего генома.

Стоимость этих технологий немного выше по сравнению с последовательностью целых геномов. Время выполнения варьируется в зависимости от используемых инструментов.

Что следует учитывать лаборатории при поиске внедрения метагеномики в свои приложения клинической микробиологии?

При внедрении метагеномики в лабораторию клинической микробиологии ключевым фактором является обеспечение доступности комплексных баз данных. Они должны быть тщательно прокручены и проверены. Виртуальные панели предлагают возможность использовать фильтры на основе синдрома для лучшей интерпретации результатов; например, фильтрация результатов на основе инфекций мочевыводящих путей или инфекций дыхательных путей.

Если цель состоит в том, чтобы использовать метагеномику для патотипирования, базы данных должны также включать маркеры, устойчивые к бактериям и грибкам, а также маркеры, устойчивые к противовирусным препаратам.

Количественная оценка является важным фактором, и способность автоматизировать отчетность помогает в разработке оптимизированных процессов отчетности, которые легко интерпретируются клиницистами.

Как выглядит типичный метагеномный рабочий процесс?

В типичном клиническом микрометагеномном рабочем процессе мы начнем с клинического образца. Положительный и отрицательный контроли определены, и мы добавляем экстракт внутреннего контроля в клинический образец (РНК и ДНК).

Обычно мы упорядочиваем все, что присутствует в образце, чтобы мы могли обнаружить любые существующие патогены, но это также будет включать нормальную флору.

На данный момент нам необходимо расставить приоритеты для результатов, чтобы составить лабораторный отчет. У нас должна быть информация об обнаруженных организмах, поэтому нам необходимо расставить приоритеты на основе ранее установленных порогов, прежде чем создавать диагностический отчет.

Для этого полезно иметь информацию о патогенах. Моя нынешняя компания добыла более 13 миллионов публикаций в PubMed, используя совместное использование названия организма и терминов заболевания.

Это позволило нам связать различные патогены с различными инфекционными заболеваниями, что в конечном итоге значительно упростило определение приоритетов патогенов, обнаруженных в клинических образцах.

На практике персонал лаборатории, заинтересованный в конкретной инфекции, может просто применить фильтр, который учитывает анализ данных, сделанный ранее.

Например, пользователи могут специально сосредоточиться на патогенах, которые участвуют в желудочно-кишечных инфекциях, и в отчете будут представлены только те патогены, которые были определены как причина желудочно-кишечной инфекции в литературе.

Не могли бы вы привести нашим читателям пример этого процесса, используемого в клинической практике?

В одном тематическом исследовании клиническая метагеномика использовалась для диагностики инфекций мочевыводящих путей. В общей сложности 115 образцов мочи с положительным и отрицательным содержанием были использованы для внутреннего контроля. Эти образцы были дополнены двумя фагами – T4 и T7.

ДНК была извлечена, и мы попытались истощить ДНК хозяина, чтобы сделать метод более чувствительным. Было выполнено секвенирование ДНК дробовика, и результаты были отфильтрованы до 97 известных уропатогенов.

Это включало 8 наиболее распространенных уропатогенов, а также 77 дополнительных бактерий и грибов. Мы использовали искусственный интеллект и машинное обучение, чтобы постоянно оптимизировать этот профиль, сообщая о результатах в полуколичественном формате и прогнозируя устойчивость к антибиотикам.

Мы сосредоточились на результатах культур, которые имеют бактериальную нагрузку более 105 колониеобразующих единиц на мл. Это важный порог в клинической микробиологии, часто потому, что это отсечение, при котором врач, вероятно, решит, что это специфическая инфекция, в данном случае инфекция мочевыводящих путей.

В зависимости от популяции пациентов, Если посмотреть на результаты культивирования и сравнить их с тем, что мы находим с использованием клинической метагеномики, то выяснилось, что в результате культивирования происходит почти 95% случаев, когда на мил приходится более 10-5 колоний.

Было обнаружено, что это меньше, когда в образцах мочи присутствовала меньшая нагрузка бактерий, уменьшая до 47% случаев, когда культура была положительной, а метагеномика дробовика – нет.

Насколько глубока должна быть последовательность, чтобы дать полезные результаты?

Это очень сильно зависит от рассматриваемого случая. Чтобы продолжить приведенный выше пример, здесь мы начали с более чем пяти миллионов чтений. Мы сократили выборку до двух миллионов образцов и сократили до 200 пар оснований (б.п.). Это дало хорошие результаты для нескольких бактерий, но мы начали терять некоторые из показателей позитивности.

Связанные истории

  • Tecan представляет платформу для разработки роботизированных инструментов для обработки жидкостей Cavro Magni Flex OEM
  • Tecan запускает быстрое решение для подготовки библиотеки RNA-Seq для определения типов образцов
  • Tecan и UgenTec предлагают решения для qPCR

В этом случае Klebsiella pneumoniae присутствовала в 9 из 10 образцов, но при использовании только 200 б.п., только 7 из 10 были положительными. Это еще больше уменьшилось, когда мы сократили выборку до более коротких показаний, обрезав до 100 пар оснований.

Этот пример показывает, что для метагеномики дробовика обычно необходимо последовательность довольно глубокая. Около 8 миллионов чтений на образец – хорошее среднее значение, и можно сделать его более чувствительным или более глубоким, но это влечет за собой дополнительные расходы.

Каковы некоторые примеры метагеномики, используемой для исследования респираторных инфекций?

В одном очень показательном примере пожилой мужчина пришел в отделение неотложной помощи Калифорнии с травмами, связанными с травмами. У него была субдуральная гематома и радиальный перелом, но у него также была гипоксия. Когда была проведена компьютерная томография, сотрудники больницы увидели ряд непрозрачных легких с появлением матового стекла.

Он был интубирован при гипоксической дыхательной недостаточности и помещен в отделение интенсивной терапии. Аспират трахеи был отправлен в клиническую лабораторию, и QPCR смог обнаружить SARS-CoV-2 у этого пациента в режиме реального времени. Когда мы использовали образец для клинической метагеномики, также был обнаружен SARS-CoV-2.

Поскольку мы охватили весь геном этого вируса, мы смогли охарактеризовать его более подробно. Мы смогли выполнить филогенетический анализ, чтобы определить, что вирус тесно связан с вирусами клады G и другими штаммами, которые, как известно, циркулируют в Соединенных Штатах.

Во втором тематическом исследовании участвовал 12-летний мужчина с историей ожирения и диабета 2 типа. Он представил своему поставщику первичной медицинской помощи правостороннее плеврит. Рентгенография грудной клетки показала инфильтрат нижней доли, поэтому пациент был госпитализирован в течение ночи и получил несколько антибиотиков.

Первоначальная диагностика проводилась с помощью ПЦР с дыхательной панелью, что показало, что этот пациент был заражен HCoV-OC43, хотя это не объясняло его пневмонию.

Пациент улучшился и был выписан на следующий день, но он вернулся через три дня, возвращаясь в отделение неотложной помощи с ухудшающимися симптомами. Когда он был госпитализирован, была проведена новая диагностика – плевральная жидкость была взята, и все аэробные и анаэробные культуры были признаны отрицательными.

Мы использовали метагеномику дробовика, и это обнаружило превотелла плеврит, редкий патоген, который только недавно был признан способным вызвать пневмонию. Получив это новое понимание, пациент был помещен в анаэробное покрытие с Меропенемом, и он заметно улучшился. Это показывает, что клиническая метагеномика очень беспристрастна и может обнаруживать сопутствующие инфекции.

В одном последнем тематическом исследовании 16-летняя женщина с лейкемией в анамнезе (которая прошла химиотерапию) столкнулась с септическим шоком. Clostridium difficile colitis также был замечен. Ее видели в Калифорнийской больнице респираторных заболеваний и поместили в PICU, где также были отмечены нарушения легких.

Был проведен ряд диагностических исследований, включая анализ галактоманнана, бактериальные / грибковые культуры и BAL с респираторной вирусной панелью. Секвенирование следующего поколения также было сделано на бесклеточной ДНК плазмы

Все начальные диагностические тесты были признаны отрицательными, но исследование с метагеномикой показало Mycoplasma hominis. Это можно лечить клиндамицином, поэтому лечение началось, и пациент значительно улучшился.

Эти примеры действительно иллюстрируют, насколько мощны эти виды технологий.

Какие преимущества дают зонды захвата по сравнению с ампликоном?

Зонды захвата более терпимы к несоответствиям и последовательностям целей, чем ПЦР, праймеры и зонды. Они подходят для использования с мишенями с высоким разнообразием, такими как РНК-вирусы. Если они разработаны с черепицей, они также могут охватывать весь геном.

Этот вид последовательности, основанной на обогащении, начинается со стандартного процесса отбора проб пациентов, положительного и отрицательного контроля, всплеска внутреннего контроля, извлечения РНК и ДНК и подготовки библиотек.

Эти предварительно обогащенные библиотеки обогащаются с помощью гибридных зондов захвата, и затем начинается секвенирование.

Интересным аспектом этого метода является то, что мы можем упорядочить обогащенные библиотеки и, если они будут признаны отрицательными, и мы хотим посмотреть, присутствует ли что-то, что изначально не было нацелено группой по обогащению, можно вернуться к предварительно обогащенным библиотекам секвенирования и упорядочить те, которые используют метагеномику дробовика.

Как только обогащенные библиотеки будут секвенированы, мы сможем обнаружить все обогащенные патогены, расставить приоритеты и создать лабораторный отчет.

Количество вирусных показаний, как правило, значительно увеличивается после обогащения, что приводит к более высокому охвату секвенирования и облегчению охвата всего генома.

Наличие всего генома позволяет нам смотреть на мутации в геноме, что может быть особенно важно при исследовании ошибок до и после вакцинации.

Наличие доступа ко всему геному также позволяет нам рассматривать несоответствия или мутации, которые могут сделать вирус более вирулентным или которые могут позволить вирусу вырваться из потенциальной вакцины в будущем.

Как вы использовали свои результаты до сих пор, чтобы улучшить обнаружение респираторных патогенов?

Мы разрабатываем более широкий спектр инструментов для обнаружения респираторных патогенов.

К ним относятся гены AMR и панель обогащения на основе Oligo, в которой мишени для РНК и ДНК могут обрабатываться при подготовке одной библиотеки, что позволяет одновременно обнаруживать и дифференцировать более 80 бактерий, 42 вируса, 53 гриба и более 1200 маркеров AMR. ,.

Используя эти инструменты, можно получить полный геном SARS-CoV-2 и других вирусов гриппа.

Обогащение значительно улучшает скорость обнаружения. Например, в одном тематическом исследовании 17 из 29 образцов, которые, как было известно, были положительными (по стандарту тестирования на уход), также были подтверждены как положительные при исследовании с использованием клинической метагеномики дробовика.

После обогащения было обнаружено, что 29 из 29 положительных образцов являются положительными, обнаружение различных респираторных патогенов в библиотеках клинических образцов значительно улучшилось за счет обогащения, даже при работе с новыми технологиями или инструментами.

Секвенирование следующего поколения в конечном итоге можно рассматривать как первый диагностический универсальный магазин в персонализированной клинической микробиологии. Он может быть использован для отслеживания вспышек и выявления источников рецидивирующих инфекций.

Он также может предсказать устойчивость или вирулентность фенотипов от секвенирования генома, что обеспечивает оптимальную терапию. Секвенирование следующего поколения также может обнаруживать мутации в геноме микробов, потенциально объясняя неудачи терапии или мутанты, спасающие вакцину. Он также предлагает объективный и не содержащий культуры способ выявления патогенов.

Обогащение повышает чувствительность при одновременном снижении затрат, потому что пользователям не нужно так глубоко секвенировать. В будущем эти виды технологий также смогут использоваться для понимания взаимодействия патоген-микробиом / виром.

О профессоре Россене

Джон Россен имеет 30-летнюю историю в области молекулярной вирусологии и микробиологии и является профессором медицинской микробиологии, в частности персонализированной микробиологии, в Университете Гронингена.

Его группа персонализированной микробиологии внедрила NGS в клиническую микробиологию и профилактику инфекций и в настоящее время сосредоточена на внедрении метагеномики и метатранскриптомики.

Эти методы применяются к образцам пациентов, животных, продуктов питания и воды, характеризующим микроорганизмы (включая вирусы) и взаимодействие между ними, а также с их хозяином. Он является непосредственным бывшим президентом исследовательской группы ESCMID по геномной и молекулярной диагностике (ESGMD) и членом правления Голландского общества медицинской микробиологии.

О Текане

Tecan является ведущим мировым поставщиком автоматизированных лабораторных приборов и решений. Их системы и компоненты помогают людям, работающим в области клинической диагностики, фундаментальных и трансляционных исследований и открытия лекарств, воплотить в жизнь свою науку.

В частности, они разрабатывают, производят, продают и поддерживают автоматизированные рабочие процессы, которые позволяют лабораториям достигать большего. Их компоненты инструментов под маркой Cavro выбираются ведущими поставщиками контрольно-измерительных приборов в различных дисциплинах.

Они работают бок о бок с целым рядом клиентов, включая диагностические лаборатории, фармацевтические и биотехнологические компании, а также университетские исследовательские центры. Их опыт распространяется на разработку и производство OEM-инструментов и компонентов, реализуемых их компаниями-партнерами. Каким бы ни был проект – большой или маленький, простой или сложный – помогая своим клиентам достичь своих целей, он на первом месте.

Они занимают лидирующие позиции во всех секторах, в которых они работают, и изменили методы работы в научно-исследовательских лабораториях по всему миру. Например, в диагностике они подняли планку, когда речь заходит о воспроизводимости и пропускной способности тестирования.

Менее чем за четыре десятилетия Tecan превратилась из швейцарского семейного бизнеса в бренд, который хорошо зарекомендовал себя на мировой арене наук о жизни. От новаторских дней на ферме до ведущей роли, которую наш бизнес берет на себя сегодня – расширение возможностей исследований, диагностики и многих прикладных рынков по всему миру

Взято из источника news-medical.net

Возможно вам понравится

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *